Новый, наномасштабный взгляд на то, как вирус SARS-CoV-2 реплицируется в клетках, может обеспечить большую точность при разработке лекарств, сообщает команда Стэнфордского университета в журнале Nature Communications. Используя передовые методы микроскопии, исследователи получили, возможно, одни из самых четких изображений вирусной РНК и репликационных структур, которые, как они стали свидетелями, образуют сферические формы вокруг ядра инфицированной клетки.
«Мы еще не видели клетки, заражающие COVID, с таким высоким разрешением, и раньше мы знали, на что смотрим», — сказал Стэнли Ци, доцент кафедры биоинженерии в инженерных и медицинских школах Стэнфорда и состарший автор статьи. «Возможность узнать, на что вы смотрите с таким высоким разрешением, с течением времени будет фундаментально полезна для вирусологии и будущих вирусных исследований, включая разработку противовирусных лекарств».
Мигающая РНК
Работа освещает молекулярные детали активности вируса внутри клеток-хозяев. Для распространения вирусы по сути захватывают клетки и превращают их в фабрики по производству вирусов, оснащенные специальными органеллами репликации. Внутри этой фабрики вирусная РНК должна дублировать себя снова и снова, пока не соберется достаточно генетического материала, чтобы выйти наружу, заразить новые клетки и начать процесс заново.
Ученые из Стэнфорда стремились раскрыть этот этап репликации в мельчайших на сегодняшний день деталях. Для этого они сначала пометили вирусную РНК и белки, связанные с репликацией, флуоресцентными молекулами разных цветов. Но визуализация светящейся РНК сама по себе привела бы к появлению нечетких пятен в обычном микроскопе. Поэтому они добавили химическое вещество, которое временно подавляет флуоресценцию. Затем молекулы снова мигали в случайное время, и только несколько из них загорались одновременно. Это облегчило определение вспышек, выявляя расположение отдельных молекул.
Используя установку, включающую лазеры, мощные микроскопы и камеру, делающую фотографии каждые 10 миллисекунд, исследователи собрали снимки мигающих молекул. Объединив наборы этих изображений, они смогли создать детально детализированные фотографии, показывающие вирусную РНК и структуры репликации в клетках.
«У нас есть высокочувствительные и специфичные методы, а также высокое разрешение», — сказал Леонид Андронов, соавтор и постдокторант химии Стэнфордского университета. «Вы можете увидеть одну вирусную молекулу внутри клетки».
Полученные изображения с разрешением 10 нанометров показывают, возможно, самое детальное представление о том, как вирус размножается внутри клетки. На изображениях видно, как пурпурная РНК образует комки вокруг ядра клетки, которые накапливаются в большой повторяющийся узор. «Мы первые, кто обнаружил, что вирусная геномная РНК образует отдельные глобулярные структуры с высоким разрешением», — сказал Мэнтинг Хан, соавтор и постдокторант биоинженерии Стэнфордского университета.
Кластеры помогают показать, как вирус уклоняется от защиты клетки, сказал У. Э. Мёрнер, со-старший автор статьи и профессор химии Гарри С. Мошера в Школе гуманитарных и естественных наук. «Они собраны вместе внутри мембраны, которая изолирует их от остальной части клетки, чтобы на них не нападала остальная часть клетки».
Наномасштабное тестирование лекарств
По сравнению с использованием электронного микроскопа , новый метод визуализации может позволить исследователям с большей уверенностью узнать, где находятся компоненты вируса в клетке, благодаря мигающим флуоресцентным меткам. Он также может предоставить наномасштабные детали клеточных процессов, которые невидимы в медицинских исследованиях, проводимых с помощью биохимических анализов.
Обычные методы «полностью отличаются от пространственных записей того, где на самом деле находятся объекты в клетке, вплоть до гораздо более высокого разрешения», — сказал Моернер. «У нас есть преимущество, основанное на флуоресцентной маркировке, потому что мы знаем, откуда исходит наш свет».
Понимание того, как именно вирус стадирует свое заражение, открывает перспективы для медицины. Наблюдение за тем, как различные вирусы захватывают клетки, может помочь ответить на вопросы, например, почему некоторые патогены вызывают легкие симптомы, а другие опасны для жизни. Микроскопия сверхвысокого разрешения также может помочь в разработке лекарств . «Эта наноразмерная структура органелл репликации может предоставить нам новые терапевтические цели», — сказал Хан. «Мы можем использовать этот метод для проверки различных лекарств и увидеть их влияние на наноструктуру».
Действительно, именно это команда и планирует сделать. Они повторят эксперимент и увидят, как вирусные структуры изменяются в присутствии таких препаратов, как Паксловид или Ремдесивир. Если лекарство-кандидат может подавить стадию репликации вируса, это говорит о том, что лекарство эффективно подавляет возбудитель и облегчает хозяину борьбу с инфекцией.
Исследователи также планируют составить карту всех 29 белков, составляющих SARS-CoV-2, и посмотреть, что эти белки делают на протяжении всего периода инфекции. «Мы надеемся, что будем готовы по-настоящему использовать эти методы для следующей задачи, чтобы быстро увидеть, что происходит внутри, и лучше это понять», — сказал Ци.
