Группа Гао Цайся из Института генетики и биологии развития Китайской академии наук (CAS) разработала новую технологию редактирования генома, которая обеспечивает эффективное и точное целенаправленное встраивание больших сегментов ДНК в растения.
Новая технология, называемая рекомбинацией подходящих мишеней, опосредованной первичным редактированием (PrimeRoot), сочетает в себе оптимизированный белок-редактор двойного ePPE, ранее опубликованный группой, с высокоэффективной тирозин-сайт-специфической рекомбиназой Cre. Он может обеспечить одноэтапную точную целевую вставку больших сегментов ДНК в рис и кукурузу с эффективностью до 6% и был использован для успешной вставки сегментов ДНК размером до 11,1 т.п.н.
Результаты были опубликованы в журнале Nature Biotechnology.
Редактирование генома — это прорывная биотехнология, имеющая широкое влияние на науки о жизни. За десятилетие, прошедшее после первых новаторских исследований CRISPR-Cas9, эта область эволюционировала от случайного, спорадического редактирования к технологиям точного редактирования. В то время как базовое редактирование и первичное редактирование эффективны при внесении небольших изменений ДНК, они не могут редактировать большие грузы. По мере развития области редактирования генома растет потребность в эффективных целенаправленных крупных вставках ДНК в геном живых клеток.
По сравнению с традиционной, неточной стратегией негомологичного соединения концов, PrimeRoot значительно повысил эффективность вставки длинных сегментов ДНК размером 5 т.п.н. и выше. Важно отметить, что события вставки абсолютно точны и предсказуемы.
В этом исследовании исследователи продемонстрировали два конкретных применения редактирования PrimeRoot. PrimeRoot использовали для вставки промотора актина (1,4 т.п.н.) выше эндогенного гена OsHPPD. Введение чужеродных функциональных элементов является важным подходом к генетической селекции для регуляции экспрессии эндогенных генов.
Затем PrimeRoot использовали для целенаправленной вставки генов в растения. Традиционные методы, основанные на посредничестве Agrobacterium и бомбардировке частицами, приводят к случайным и неточным событиям вставки .
Исследователи использовали PrimeRoot для точной вставки гена устойчивости риса pigmR к пирикуляриозу в предполагаемую геномную безопасную гавань для достижения быстрой селекции устойчивости к болезням.
Чтобы повысить эффективность PrimeRoot, исследователи создали систему последовательного преобразования риса. Эта система дополнительно повысила эффективность редактирования в два-четыре раза по сравнению с однократной однократной трансформацией, таким образом достигнув эффективности до 8,3% для вставки промотора актина (1,4 т.п.н.) и эффективности до 6,3% для вставки всего каркаса экспрессии гена pigmR. (4,9 кб).
Эта технология обеспечивает мощную техническую поддержку для молекулярной селекции растений и исследований в области синтетической биологии растений.