Подобно тому, как врачи стремятся глубже сканировать тело с помощью сонограмм, КТ и МРТ, а астрономы стремятся заглянуть во вселенную с помощью космических телескопов, адаптивной оптики и различных длин волн света, нейробиологи ищут новые способы наблюдения за клетками мозга. работать глубоко внутри мозга. Недавно появилась трехфотонная микроскопия, чтобы дать им более глубокий взгляд на клетки мозга, чем когда-либо прежде. Теперь, основываясь на существенном усовершенствовании технологии, ученые из Массачусетского технологического института провели первое в истории исследование стимулированной нейронной активности у бодрствующей мыши через каждый слой зрительной коры и, в частности, таинственную «пластинку» ниже.

«Оптимизировав оптический дизайн и другие функции для параметров для проведения измерений в живом мозге, мы смогли сделать новые открытия, которые раньше были невозможны», — сказал соавтор статьи Мриганка Сур, профессор нейронологии Ньютона в Институте Пикауэра. для обучения и памяти.

Соавторами статьи являются постдоки Мурат Йилдирим и Хироки Сугихара. Другой соответствующий автор — Питер Со, профессор машиностроения и биологической инженерии.

«Концепция существовала, но вопрос был в том, как заставить ее работать», — сказал Сур.

В исследовании, опубликованном в Nature Communications , команда показала, что, когда мыши наблюдали за зрительными стимулами, их наблюдатели-люди могли измерять закономерности активности нейронов во всех шести слоях зрительной коры головного мозга и нижней пластинки, предоставляя новые данные об их роли в процессе млекопитающих. видение. Более того, благодаря серии тщательных экспериментов исследователи смогли показать, что свет, который они посылали, а также свет, который возвращался, не повредил и даже не изменил клетки, которые они измерили.

В целом, в документе описывается новый трехфотонный микроскоп, оптимизированный для доставки быстрых коротких импульсов малой мощности света, способных достигать глубоких целей без какого-либо функционального нарушения или физического повреждения, а затем для обнаружения результирующей флуоресценции, испускаемой клетками с высокая эффективность для получения изображений с резким разрешением и высокой частотой кадров.

«Мы были заинтересованы показать, что мы можем сделать с помощью технологии трехфотонного микроскопа для животного в состоянии бодрствования, чтобы мы могли задавать важные вопросы нейробиологии», — сказал Йилдирим. «Можно подумать, что у вас самый лучший в мире микроскоп, но пока вы не зададите эти вопросы, вы не знаете, какие результаты вы получите».

Фемтосекунды и наноджоули

Теория многофотонной микроскопии восходит к докторской диссертации Марии Гепперт-Майер 1931 года, работа которой показала, что одновременная комбинация фотонов с более низкой энергией может возбудить атом или молекулу в состояние с более высокой энергией, подобно единственному фотону с более высокой энергией мог. В 1990 году ученые Корнелльского университета применили это понимание для биологической визуализации в двухфотонном микроскопе, а затем в 2013 году в трехфотонной области. Это позволило нейробиологам глубже заглянуть в мозг, потому что фотоны с более низкой энергией и большей длиной волны менее восприимчивы к рассеиванию фотонами с более короткими волнами с более высокой энергией клеточными молекулами, такими как липиды.

Лаборатории Сур и Со в Массачусетском технологическом институте объединили свои усилия в расширении границ многофотонной микроскопии. В новом исследовании они показывают, что теперь достаточно далеко изучили нейронную активность, Чтобы сделать это, команда стремилась уточнить множество различных параметров как лазерного света, так и оптического прицела, основываясь на тщательных измерениях свойств ткани мозга, которые они визуализировали. Например, они не только измерили энергию, при которой клетки начали демонстрировать явное повреждение (около 10 наноджоулей), но также измерили мощность, при которой клетки начали вести себя по-другому, создавая тем самым данные, на которые повлияло измерение (от 2 до 5 наноджоулей) , С точностью и целью обеспечить более низкие уровни энергии, ученые оптимизировали прицел, чтобы излучать невероятно короткие импульсы света продолжительностью «длительности импульса» всего 40 фемтосекунд или квадриллионов долей секунды, и тщательно настроили оптику, чтобы максимизировать сбор свет, который молекулы, возбуждаемые поступающей лазерной энергией, будут излучать обратно.

В этом фильме, сделанном с использованием нового трехфотонного микроскопа, разработанного в Институте обучения и памяти им. Пикауэра, полностью погрузитесь в зрительную зону коры головного мозга от поверхности до нижней пластины. Зеленый указывает на нервную активность, тогда как пурпурный цвет обозначает кровеносные сосуды и волокна белого вещества.

Беспрецедентная неврология

После тщательной проверки того, что измерения оптимизированной трехфотонной области соответствуют измерениям двухфотонной области (в более мелких слоях коры) и электрофизиологии (которая может идти глубже, но вслепую), команда решила сделать беспрецедентную неврологию — прямую визуальное наблюдение за нейронной активностью во всех слоях коры бодрствования, поведения животных.

В лаборатории они показали мышам несколько решеток в 12 различных повернутых ориентациях и двух направлениях движения по экрану. С их оптимизированным трехфотонным размахом они наблюдали за нейронами в каждом слое коры — глубиной более миллиметра — чтобы увидеть, как клетки реагируют на этот стандартный визуальный вход. Они могли видеть активность клеток, потому что они заставили их светиться при повышенной активности кальция, используя метку под названием GCaMP6. Они могли видеть другие ткани, такие как кровеносные сосуды и белое вещество, с помощью явления, называемого «генерация третьей гармоники».

Обладая способностью видеть самые глубокие слои, они обнаружили, что нейроны слоя 5 «широко» настроены на ориентацию, что означает, что они реагируют на широкий спектр ориентаций, а не только на одну или две специфические. Нейроны 5-го уровня также обладали большей спонтанной активностью, чем клетки в других слоях, и имели больше связей с более глубокими частями мозга. Между тем, нейроны 6-го слоя имели более острую настройку ориентации, чем нейроны в других слоях, что означает, что они более специфичны в своем ответе на различные ориентации.

Сюжетный сюрприз

Их самое удивительное открытие состояло в том, что на пластинке, тонком слое в основном нейронных волокон «белого вещества», находилась популяция нейронов с паттернами активности, которые были слабо и широко настроены на визуальный вклад. Исследователи заявили, что это открытие было откровением, так как многие нейробиологи полагали, что нейроны субпластин были в основном активны только во время развития. По словам Йилдирима, слой также слишком тонкий, чтобы его можно было измерить с помощью электрофизиологии.

«До сих пор нейроны субпластин в зрелом мозге вообще не изучались из-за технических проблем визуализации этих клеток in vivo», — пишут исследователи.

Сугихара вспоминает, как Йилдирим впервые показал ему, что нейроны субпластин были активны у зрелых мышей. «Что они там делают?» он вспомнил вопрос с удивлением.

Теперь они продолжают использовать свои новые возможности для ответа на этот вопрос.