Работа исследователя подразумевает не только постоянное стремление к новым открытиям, но и пристальное внимание к общепринятым, устоявшимся знаниям. Иногда надежные и, казалось бы, проверенные методы обладают характеристиками, которые ранее игнорировались.

Группа исследователей под руководством декана факультета биологии и биотехнологии НИУ ВШЭ Александра Тоневицкого обнаружила такие особенности в методе сверхэкспрессии микроРНК. Ученые установили, что в некоторых случаях результаты экспериментов с использованием этого метода могут быть некорректными, и эти ошибки очень сложно обнаружить. Результаты исследования опубликованы в журнале Biochimica et Biophysica Acta (BBA)—Gene Regulatory Mechanisms .

МикроРНК (миРНК) — это небольшие молекулы РНК, длиной приблизительно от 20 до 25 нуклеотидов. Они играют важную роль в регуляции экспрессии генов, определяя, сколько белка будет синтезировано в клетке из определенной молекулы информационной РНК (мРНК). Эта регуляция осуществляется с помощью короткого фрагмента внутри микроРНК, который может связываться с целевой молекулой мРНК, если он находит обратную комплементарную (биологически совместимую) последовательность. Когда это происходит, синтез белка из мРНК останавливается, что приводит к снижению экспрессии генов.

По мере прогрессирования заболеваний, включая рак, наблюдаются изменения в уровнях экспрессии микроРНК. В частности, при раке простаты увеличивается количество микроРНК miR-93-5p, и более высокие уровни их экспрессии связаны с большей агрессивностью заболевания. Значительно увеличивая количество микроРНК в лабораторных клетках, исследователи могут получить более четкое представление о процессах, связанных с повышенной экспрессией этой микроРНК.

Обычный подход к сверхэкспрессии miRNA включает первоначальное увеличение количества предшественника РНК в клетках — более длинной молекулы, из которой впоследствии генерируется miRNA посредством расщепления ферментом Dicer. Это естественный процесс для клетки. Однако последовательность miRNA, образующихся в результате, зависит от того, насколько точно фермент Dicer расщепляет молекулу-предшественника.

Авторы статьи изучали, как фермент Dicer расщепляет молекулу. Они закодировали нужную последовательность в молекуле-предшественнике, ожидая, что Dicer точно расщепит ее, как и предполагалось. Однако оказалось, что Dicer не всегда работает так, как ожидают ученые. Фермент в первую очередь функционирует как молекулярная линейка, последовательно измеряя длину 22 нуклеотидов.

В процессе синтеза молекулы-предшественника к концу последовательности обычно добавляется один или несколько урацилов (нуклеотидное основание, уникальное для РНК). В результате, если данная последовательность miRNA длиннее 19 нуклеотидов, добавленные урацилы заставляют Dicer расщеплять молекулу в непреднамеренном месте. Этот сдвиг приводит к образованию изоформ miRNA.

Чтобы исследовать причину сдвига позиции расщепления молекулы-предшественника, ученые экспериментально установили несколько последовательностей miRNA различной длины, включая 23-нуклеотидную цепочку, соответствующую miRNA miR-93-5p. Используя секвенирование — метод, который полностью расшифровывает нуклеотидную последовательность молекул РНК или ДНК, — ученые наблюдали, что добавленные урацилы в цепях длиннее 19 нуклеотидов вызывают сдвиг позиции расщепления.

Образование изоформ miRNA miR-93-5p привело к снижению экспрессии гена HMGA1, который играет роль в нарушении передачи генетической информации во время деления клеток и в регуляции экспрессии генов . Однако HMGA1 не был целью стандартной формы miR-93-5p. Без знания образования изоформ miRNA можно было бы сделать неверные выводы о молекулярных механизмах изучаемой miRNA при раке простаты.

«Изоформы могут воздействовать на неправильные молекулы мРНК вместо тех, которые предполагались в эксперименте, что приводит к подавлению непреднамеренных генов. Понимание этой особенности имеет решающее значение как для фундаментальных исследований, так и для медицинских приложений », — считает Диана Мальцева, заведующая Международной лабораторией микрофизиологических систем НИУ ВШЭ.

Ученые по всему миру используют в своих экспериментах метод сверхэкспрессии miRNA. Обычно точность результатов проверяется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Однако в данном случае этот метод оказался недостаточно чувствительным.

«Наше исследование показало, что только секвенирование может выявить сдвиг в позиции расщепления. К сожалению, секвенирование — относительно дорогой метод, и не все лаборатории могут себе его позволить. Поэтому крайне важно разрабатывать новые методы сверхэкспрессии miRNA и тщательно планировать эксперименты», — комментирует Мальцева.