Исследователи из Университета Кобе успешно разработали тирозиновое шасси (штамм микроорганизма с высокой продуктивностью тирозина) в дрожжах Pichia pastoris с помощью рациональной инженерии. Кроме того, они использовали это тирозиновое шасси для разработки «умных» клеток, которые могут производить растительные соединения ресвератрол, нарингенин, норкоклаурин и ретикулин соответственно. Эти соединения имеют широкий спектр применения; например, они используются для добавления питательных веществ в продукты питания и в качестве сырья для лекарств. Есть надежда, что это тирозиновое шасси можно будет использовать в качестве отправной точки для высокопроизводительного биосинтеза различных полезных соединений и непатентованных химикатов.

Это исследование Университета Кобе было проведено исследовательской группой, в которую входил доктор философии. студент Кумокита Рёта (Высшая школа науки, технологий и инноваций) и профессор Хасунума Томохиса (Исследовательский центр инженерной биологии).

Эти результаты исследования были опубликованы в международном научном журнале ACS Synthetic Biology 16 мая 2022 года.

Биоактивные ароматические соединения растительного происхождения, такие как стильбеноиды, флавоноиды и бензилизохинолиновые алкалоиды (БИА), производятся из тирозина . Эти соединения имеют широкий спектр применения во многих отраслях промышленности, включая химическое производство , пищевую, косметическую и фармацевтическую промышленность. Эти ароматические соединения в настоящее время производятся путем прямой экстракции из растений, однако внутри растений обнаруживаются лишь небольшие количества, а выход сильно зависит от погоды и климата. Нет стабильного предложения.

В последние годы достижения в области синтетической биологии привели к разработке методов получения полезных соединений. В этих методах используется способность микроорганизмов производить вещества путем введения в микроорганизм метаболических путей растительного происхождения , чтобы он производил целевое соединение. Из микроорганизмов дрожжи привлекли внимание как хозяева для производства соединений, потому что они преуспели в биосинтезе соединений растительного происхождения. Однако потенциал дрожжей для производства производных тирозина соединений был неясен, поскольку сообщалось о немногих успехах.

В этом исследовании исследователи начали с создания штамма дрожжей, который мог бы давать высокие выходы тирозина. Используя этот новый штамм в качестве отправной точки, они внесли изменения в его метаболизм для достижения вышеупомянутой цели получения высоких выходов различных полезных соединений. Тип дрожжей, на котором они сосредоточились, был P. pastoris. P. pastoris быстро размножается в аэробных условиях и не производит побочных продуктов ферментации (этанол), что означает, что он может давать высокие выходы целевого соединения за короткий промежуток времени. Однако ни в одном исследовании не сообщалось о производстве производных тирозина соединений в P. pastoris, и не было известно, какие гены будут полезны для получения высоких урожаев. Проводя простую оценку количества вырабатываемого тирозина, исследователи также искали гены, улучшающие выработку тирозина.

Прежде всего, исследователи намеревались найти в штаммах дрожжей гены, повышающие выработку тирозина. Для этого они сосредоточились на бетаксантине, который можно получить из тирозина в ходе трехэтапной реакции.

Бетаксантин — желтый пигмент, излучающий зеленую флуоресценцию. Следовательно, легко оценить силу метаболического потока на тирозин, глядя на интенсивность и цвет флуоресценции. При создании этого метода оценки исследователи обнаружили гены, повышающие продуктивность тирозина, и использовали эти знания для успешного создания штамма P. pastoris с высокой продуктивностью тирозина.

Следующей целью исследователей было улучшить скорость производства различных полезных соединений, полученных из тирозина, путем изменения метаболизма высокопродуктивного штамма. Им удалось значительно улучшить выработку ресвератрола, нарингенина и норкоклаурина за счет введения специфических путей биосинтеза (рис. 1) для каждого из них, показав, что P. pastoris может продуцировать соединения, производные тирозина, с высоким выходом (рис. 3).

Впоследствии исследовательская группа всесторонне проанализировала внутриклеточные метаболиты в новом штамме P. pastoris, который они разработали, и исследовала механизм высокой продукции тирозина. Результаты показали, что в сконструированном штамме накапливается большое количество метаболитов шикиматного пути, участвующих в синтезе тирозина и тирозина (рис. 4). Эти результаты показывают, что изменение метаболизма успешно увеличивает метаболический поток в тирозин. В будущем существует потенциал для дальнейшего увеличения производства полезных соединений, которые могут быть биосинтезированы из тирозина путем оптимизации метаболизма шикиматного пути.

Наконец, исследователи стремились получить производные тирозина соединения путем ферментации с сырым глицерином в качестве питательной среды. Сырой глицерин является основным побочным продуктом производства биодизельного топлива (потенциальная альтернатива нефтехимическому топливу). Исследовательская группа использовала жидкость (рис. 5, справа), полученную в результате нейтрализации неочищенного глицерина, в качестве питательной среды в эксперименте по производству микробов. В этом эксперименте им удалось получить те же количества ресвератрола, нарингенина и норкоклаурина, что и при использовании чистого глицерина. Эти результаты показывают, что P. pastoris может производить полезные соединения не только из чистого глицерина, но и из неочищенного глицерина.

Тирозиновое шасси, разработанное в ходе этого исследования, можно применять для ферментативного производства различных полезных соединений и непатентованных химических веществ, которые можно биосинтезировать из тирозина. Кроме того, исследователи надеются еще больше увеличить производство производных тирозина соединений, используя результаты анализа метаболома их нового штамма P. pastoris в качестве основы для оптимизации метаболических путей.