Что бы вы ни делали, будь то вождение автомобиля, пробежка или даже самое ленивое поедание чипсов и просмотр телевизора на диване, внутри каждой из ваших клеток усердно работает целый набор молекулярных механизмов. Этот механизм, слишком маленький, чтобы его можно было увидеть невооруженным глазом или даже во многие микроскопы, создает энергию для клетки, производит ее белки, делает копии ее ДНК и многое другое.

Среди этих механизмов, и одним из самых сложных, является то, что известно как комплекс ядерных пор (NPC). NPC, который состоит из более чем 1000 отдельных белков, является невероятно разборчивым привратником для клеточного ядра, связанной с мембраной области внутри клетки, которая содержит генетический материал этой клетки. Все, что входит или выходит из ядра, должно пройти через NPC на своем пути.

Роль NPC как привратника ядра означает, что он жизненно важен для работы клетки. Внутри ядра ДНК, постоянный генетический код клетки, копируется в РНК. Затем эта РНК выносится из ядра, чтобы ее можно было использовать для производства белков, необходимых клетке. NPC гарантирует, что ядро ​​получит материалы, необходимые для синтеза РНК, а также защитит ДНК от суровых условий вне ядра и позволит РНК покинуть ядро ​​после того, как оно было создано.

«Это немного похоже на ангар для самолетов, где вы можете ремонтировать Боинг-747, и дверь открывается, чтобы впустить Боинг-747, но там стоит человек, который может не дать ни одному шарику вылететь, пока двери открыты», — говорит Андре из Калифорнийского технологического института. Хёльц, профессор химии и биохимии и научный сотрудник Медицинского института Говарда Хьюза. Более двух десятилетий Хоэлц изучал и расшифровывал структуру NPC в связи с ее функциями. На протяжении многих лет он неуклонно разгадывал ее секреты, разгадывая их по частям.

Последствия этого исследования потенциально огромны. NPC не только играет центральную роль в функционировании клетки, но и участвует во многих заболеваниях. Мутации в NPC ответственны за некоторые неизлечимые виды рака, за нейродегенеративные и аутоиммунные заболевания, такие как боковой амиотрофический склероз (БАС) и острую некротизирующую энцефалопатию, а также за сердечные заболевания, включая мерцательную аритмию и раннюю внезапную сердечную смерть. Кроме того, многие вирусы, в том числе вирус, ответственный за COVID-19, нацелены на NPC и отключают их в течение своего жизненного цикла.

Теперь, в паре статей, опубликованных в журнале Science, Хёльц и его исследовательская группа описывают два важных прорыва: определение структуры внешней поверхности NPC и выяснение механизма, с помощью которого специальные белки действуют как молекулярный клей. чтобы сплотить NPC.

Очень маленькая 3D-головоломка.

В своей статье под названием «Архитектура цитоплазматической поверхности ядерной поры» Хёльц и его исследовательская группа описывают, как они нанесли на карту структуру стороны NPC, которая обращена наружу от ядра и в цитоплазму клеток. Для этого им пришлось решить эквивалент очень крошечной трехмерной головоломки , используя такие методы визуализации, как электронная микроскопия и рентгеновская кристаллография для каждой части головоломки.

Стефан Петрович, аспирант в области биохимии и молекулярной биофизики и один из соавторов статей, говорит, что процесс начался с бактерий Escherichia coli (штамм бактерий, обычно используемых в лабораториях), которые были генетически модифицированы для производства белков, которые составляют человеческий NPC.

«Если вы войдете в лабораторию, вы увидите эту гигантскую стену колб, в которых растут культуры», — говорит Петрович. «Мы экспрессируем каждый отдельный белок в клетках E. coli, вскрываем эти клетки и химически очищаем каждый белковый компонент».

Как только эта очистка, для которой может потребоваться до 1500 литров бактериальной культуры, чтобы получить достаточно материала для одного эксперимента, была завершена, исследовательская группа начала кропотливо проверять, как части NPC подходят друг к другу.

Джордж Моббс, старший научный сотрудник по химии с докторской степенью и еще один соавтор статьи, говорит, что сборка происходила «пошагово»; вместо того, чтобы одновременно выливать все белки в пробирку , исследователи протестировали пары белков, чтобы увидеть, какие из них будут сочетаться друг с другом, как две части головоломки. Если обнаруживалась пара, подходящая друг к другу, исследователи сравнивали два уже объединенных белка с третьим белком до тех пор, пока не находили тот, который подходит этой паре, а затем полученную структуру из трех частей проверяли на соответствие другим белкам, и так далее. на. Работая таким образом с белками, в конечном итоге они получили окончательный результат своей работы: клин из 16 белков, который повторяется восемь раз, как кусочки пиццы, чтобы сформировать лицо NPC.

«Мы сообщили о первой полной структуре всего цитоплазматического лица человеческого NPC вместе со строгой проверкой вместо того, чтобы сообщать о серии постепенных сдвигов фрагментов или частей, основанных на частичном, неполном или низком разрешении наблюдения», — говорит Си Ни. , научный сотрудник с докторской степенью в области химии, а также соавтор статьи. «Мы решили терпеливо ждать, пока не получим все необходимые данные, сообщив огромное количество новой информации».

Их работа дополняла исследование, проведенное Мартином Беком из Института биофизики Макса Планка во Франкфурте, Германия, чья команда использовала криоэлектронную томографию для создания карты, которая дала контуры головоломки, в которую исследователи должны были поместить кусочки. Чтобы ускорить решение загадки структуры человеческого NPC, Хёльц и Бек обменялись данными более двух лет назад, а затем независимо построили структуры всего NPC. «Существенно улучшенная карта Бека намного четче показала, где каждая часть NPC, для которой мы определили атомарные структуры, должна была быть размещена, подобно деревянной раме, которая определяет край головоломки», — говорит Хёльц.

Экспериментально определенные структуры частей NPC от группы Hoelz послужили для проверки моделирования группой Beck. «Мы размещали структуры на карте независимо друг от друга, используя разные подходы, но окончательные результаты полностью совпали. Было очень приятно это видеть», — говорит Петрович.

«Мы создали основу, на которой теперь можно проводить множество экспериментов», — говорит Кристофер Блей, старший научный сотрудник в области химии, а также соавтор. «Сейчас у нас есть эта составная структура, и она позволяет проводить будущие эксперименты с функциями NPC или даже с болезнями. В NPC есть много мутаций, связанных с ужасными болезнями, и зная, где они находятся в структуре и как они объединившись, мы можем помочь разработать следующую серию экспериментов, чтобы попытаться ответить на вопросы о том, что делают эти мутации».

«Элегантная композиция из лапши спагетти»

В другой статье, озаглавленной «Архитектура линкерного каркаса в ядерной поре», исследовательская группа описывает, как она определила всю структуру так называемого линкерного каркаса NPC — набора белков, которые помогают удерживать NPC вместе. в то же время обеспечивая ему гибкость, необходимую для открытия и закрытия, а также для адаптации к проходящим молекулам.

Хёльц сравнивает NPC с чем-то, построенным из кирпичиков Lego, которые соединяются друг с другом, не сцепляясь друг с другом, а вместо этого соединяются вместе резиновыми лентами, которые удерживают их в основном на месте, но при этом позволяют им немного двигаться.

«Я называю эти неструктурированные кусочки клея «темной материей пор», — говорит Хёльц. «Элегантная композиция из спагетти скрепляет все воедино».

Процесс характеристики структуры линкер-каркаса был во многом таким же, как и процесс, используемый для характеристики других частей NPC. Команда произвела и очистила большое количество многих типов линкерных и каркасных белков, использовала различные биохимические эксперименты и методы визуализации для изучения отдельных взаимодействий и проверила их по частям, чтобы увидеть, как они сочетаются друг с другом в неповрежденном NPC.

Чтобы проверить свою работу, они ввели мутации в гены, кодирующие каждый из этих линкерных белков в живой клетке. Поскольку они знали, как эти мутации изменят химические свойства и форму определенного линкерного белка, сделав его дефектным, они могли предсказать, что произойдет со структурой клеточных NPC при введении этих дефектных белков. Если NPC клетки были функционально и структурно дефектными, как они ожидали, они знали, что имеют правильное расположение линкерных белков.

«Клетка намного сложнее, чем простая система, которую мы создаем в пробирке, поэтому необходимо убедиться, что результаты, полученные в экспериментах in vitro, сохраняются в естественных условиях», — говорит Петрович.

Сборка внешнего лица NPC также помогла решить давнюю загадку ядерной оболочки, двойной мембранной системы, окружающей ядро. Подобно мембране клетки, внутри которой находится ядро, ядерная мембрана не является идеально гладкой. Скорее, он усеян молекулами, называемыми интегральными мембранными белками (IMP), которые выполняют различные роли, в том числе действуют как рецепторы и помогают катализировать биохимические реакции.

Хотя IMP можно найти как на внутренней, так и на внешней стороне ядерной оболочки, было неясно, как они на самом деле перемещаются с одной стороны на другую. Действительно, поскольку IMP застревают внутри мембраны, они не могут просто скользить по центральному транспортному каналу NPC, как это делают свободно плавающие молекулы.

Как только команда Хёльца поняла структуру линкерного каркаса NPC, они поняли, что он позволяет формировать небольшие «желоба» вокруг его внешнего края, которые позволяют IMP проскальзывать мимо NPC с одной стороны ядерной оболочки на другую, в то время как всегда остаются встроенными в саму мембрану.

«Это объясняет многое из того, что было загадочным в этой области. Я очень рад видеть, что центральный транспортный канал действительно имеет возможность расширяться и образовывать боковые ворота для этих ИМП, как мы первоначально предложили более десяти лет назад. «, — говорит Хёльц.

Взятые вместе, результаты двух работ представляют собой скачок вперед в понимании учеными того, как устроен человеческий NPC и как он работает. Открытия команды открывают двери для гораздо большего количества исследований. «Определив его структуру, мы теперь можем сосредоточиться на разработке молекулярных основ для функций NPC, таких как экспорт мРНК и основные причины многих заболеваний, связанных с NPC, с целью разработки новых методов лечения», — говорит Хёльц.

Статьи с описанием работы опубликованы в номере журнала Science от 10 июня.