ДНК, которую часто называют «планом жизни», содержит инструкции по созданию белков, которые необходимы клеткам для выживания и правильного функционирования. Но ДНК не идеальна, и во время репликации могут возникать ошибки. Иногда это может привести к тому, что фрагменты строительных блоков ДНК, называемых нуклеотидами — G (гуанин), A (аденин), T (тимин), C (цитозин) — повторяются слишком много раз подряд.

Это может привести к мутации, известной как расширение нуклеотидных повторов, которая может изменить функцию и структуру жизненно важных белков и привести к редким нейродегенеративным состояниям, таким как болезнь Хантингтона и боковой амиотрофический склероз (АЛС).

Новое исследование члена Института Уайтхеда Анкура Джайн, аспиранта Рэйчел Андерсон и их коллег более внимательно изучает, как повторяющаяся последовательность, участвующая в болезни Хантингтона (CAG-повтор), приводит к выработке аномальных белков, которые неправильно сворачиваются и слипаются внутри клеток, закупоривая их. активизируют важные клеточные процессы.

Их результаты , опубликованные в журнале Molecular Cell 30 января, показывают, что расширенный повтор CAG может мешать сплайсингу. Как показано на иллюстрации ниже, это процесс, при котором вырезаются части РНК, которые не кодируют белки, также известные как интроны. Оставшиеся участки, называемые экзонами, затем соединяются вместе, образуя окончательную информационную РНК, которая несет инструкции по построению белка .

По мнению исследователей, расширенный CAG-повтор создает новые маркеры или акцепторные сайты сплайсинга, что приводит к тому, что вырезание и вставка генетической информации происходит на других соединениях, чем обычно.

«Вопрос о том, почему мозг пациентов с расстройствами повторного расширения содержит ложные белки, уже некоторое время ставит ученых в тупик», — говорит Джайн, который также является доцентом биологии и профессором развития карьеры Томаса Д. и Вирджинии В. Кэбот в Университете. Массачусетский Институт Технологий. «Теперь, поскольку у нас есть понимание молекулярного механизма, мы можем попытаться воздействовать на путь сплайсинга и уменьшить выработку этих белков».

Разворачивающиеся шпильки РНК

РНК менее стабильна, чем ДНК, и распространенные подходы к анализу РНК основаны на использовании фермента, называемого обратной транскриптазой. Хотя обычно в клетке ДНК считывается в РНК, этот фермент считывает молекулы РНК в комплементарную цепь ДНК (кДНК). Это позволяет исследователям внимательно анализировать последовательности РНК без риска деградации генетической информации.

Но обратная транскрипция РНК, содержащих повторы, имеет свои собственные проблемы — эти молекулы имеют тенденцию сворачиваться, образуя шпильки, и когда эти петли не полностью раскручиваются во время обратной транскрипции, у исследователей остаются пробелы и ошибки в кДНК.

В новой статье Джайн и Андерсон использовали другой подход для чувствительной обратной транскрипции РНК, содержащей повторы, в кДНК. В частности, исследователи работали с ферментом под названием TGIRT (термостабильная обратная транскриптаза интрона группы II), который остается активным при высоких температурах, что позволяет ему разрывать шпильковые структуры и захватывать последовательности, содержащие повторы, с более высокой точностью.

«Когда вы нагреваете яйцо, оно желтеет, потому что белки в яйце разворачиваются под воздействием высокой температуры. Мы используем то же самое, но со структурами РНК», — говорит Андерсон.

Затем исследователи начали сопоставлять эти повторы с эталонным геномом, который служит ориентиром для генетической информации человека, но они быстро столкнулись с проблемами. «Буквы», составляющие GATC генома человека, объединяются в различных последовательностях, образуя нити ДНК в наших клетках.

Это означает, что повторяющиеся паттерны в геноме человека неизбежны (заболевания, основанные на повторении, возникают только тогда, когда одна последовательность, например CAG, повторяется слишком много раз подряд), и каждый паттерн может возникать в нескольких местах генома. Таким образом, определение того, откуда возникла РНК, содержащая повторы, похоже на реконструкцию истории из фрагментированных предложений без контекста.

«Именно тогда мы решили по-другому подойти к картированию повторов», — говорит Андерсон. Исследователи разработали новый инструмент под названием SATCfinder, который выбирает последовательности РНК, содержащие как минимум три повтора CAG. Затем эти повторы обрезаются вычислительным путем, а остальная часть последовательности наносится на эталонный геном. Местоположение или картографические координаты паттерна непосредственно перед повтором CAG отслеживаются, что позволяет исследователям затем точно определить, куда должны идти повторы.

Рассмотрим подробнее сращивание

Предыдущая работа лаборатории Джайн показала, что, как только содержащие повторы РНК покидают ядро ​​и достигают цитоплазмы клетки, они образуют гелеобразные комки.

Обычно в цитоплазме РНК взаимодействуют с клеточным механизмом, который ищет на РНК маркер, называемый стартовым кодоном, чтобы начать трансляцию инструкций для построения белков. Исследователи предположили, что РНК, содержащие повторы, могут сбивать с толку механизм, заставляя его транслировать инструкции из разных отправных точек. Этот процесс, называемый трансляцией RAN, может затем привести к созданию ненужных белков, которые не только склонны к слипанию, но и способствуют склеиванию РНК в цитоплазме.

Но это объяснение не совсем удовлетворило Джайна и Андерсона, и они хотели узнать больше о том, почему содержащие повторы РНК вообще приводят к случайной трансляции инструкций. Чтобы исследовать это, они создали набор последовательностей с паттерном «CAG», повторенным 240 раз подряд. Как они и ожидали, когда эти последовательности достигли цитоплазмы, они начали агрегировать.

Когда исследователи выполнили секвенирование РНК на этих клетках и проанализировали результаты с помощью SATCfinder, они нашли ответ: повторы CAG в РНК часто пришивались к неожиданным последовательностям, расположенным дальше от повтора в ДНК, с вырезанием промежуточных участков. Это означало, что присутствие CAG-повторов несколько раз подряд приводило к созданию новых участков разрезания и склеивания по краям самого повтора, создавая аномальные транскрипты РНК, которые затем производят белки, которые неправильно сворачиваются и слипаются.

Теперь исследователи из лаборатории Джайн заинтересованы в дальнейшем изучении того, как расширенный повтор CAG вызывает ошибки при сплайсинге. Они также надеются узнать больше о том, в какой степени эти ошибки сращивания способствуют развитию таких заболеваний, как болезнь Хантингтона.

«Существует множество механизмов, которые объединяются и способствуют гибели клеток при болезни Хантингтона. Это одна часть головоломки, которая способствует нашему молекулярному пониманию того, как эти повторы искажают клеточные функции», — говорит Джайн.