Исследователи Солка нанесли на карту геномы и эпигеномы генетически модифицированных линий растений с самым высоким разрешением, когда-либо существовавшим, чтобы точно определить, что происходит на молекулярном уровне, когда вставляется кусок чужеродной ДНК. Их результаты, опубликованные в журнале PLOS Genetics 15 января 2019 года, разъясняют рутинные методы, используемые для модификации растений, и предлагают новые способы более эффективного сведения к минимуму потенциальных побочных эффектов.

«Это было действительно отправной точкой для того, чтобы показать, что можно использовать новейшие технологии картирования и секвенирования, чтобы оценить влияние вставки генов в геном растения» , — говорит исследователь Медицинского института Говарда Хьюза Джозеф Экер (Joseph Ecker), профессор факультета молекулярной растительности Солка. Лаборатория клеточной биологии и заведующая лабораторией геномного анализа.

Когда ученый хочет внедрить новый ген в растение — для фундаментальных исследовательских целей или для улучшения здоровья или питания продовольственной культуры — они обычно полагаются на Agrobacterium tumefaciens, чтобы выполнить свою работу. Agrobacterium — это бактерии, вызывающие опухоли крон-желчного пузыря, большие выпуклости на стволах деревьев. Несколько десятилетий назад ученые обнаружили, что когда бактерии заражают дерево, оно переносит часть своей ДНК в геном дерева. С тех пор исследователи использовали эту способность переноса Agrobacterium для своих собственных целей, используя его переносящую ДНК (Т-ДНК) для перемещения нужного гена в растение.

Недавно технологии секвенирования ДНК начали намекать, что когда T-ДНК Agrobacterium используется для введения новых генов в растение, это может вызвать дополнительные изменения в структурных и химических свойствах нативной ДНК.

«Биотехнологические компании тратят много времени и усилий на то, чтобы охарактеризовать трансгенные растения и игнорировать кандидатов с нежелательными изменениями, не понимая — с базовой биологической точки зрения — почему эти изменения могли произойти», — говорит Экер. «Наш новый подход предлагает способ лучше понять эти эффекты и может помочь ускорить процесс».

«Самым большим неизвестным было то, было ли и сколько копий Т-ДНК вставлено в то же самое время, что и та часть, которую вы хотели», — говорит Флориан Юп, бывший научный сотрудник Salk, который сейчас работает в Bayer Crop Science. Юп, научный сотрудник Salk Марк Цандер и научный сотрудник Анджелина Ривкин являются соавторами новой статьи вместе с Тоддом Майклом из Института Дж. Крейга Вентера.

Поскольку подход Т-ДНК может привести к интеграции множества копий желаемого гена в растение, может быть трудно изучить конечный результат при стандартном секвенировании ДНК, так как большинство технологий борются за последовательность очень повторяющихся участков ДНК. Но Экер и его коллеги обратились к новой комбинации подходов, включая оптическое картирование и секвенирование нанопор, чтобы посмотреть на эти длинные участки в высоком разрешении. Они применили технологии к четырем случайно выбранным линиям Т-ДНК Arabidopsis thaliana , широко используемого в биологии модельного растения. (Эти растения получены из большой популяции инсерционных мутантов Т-ДНК, которые были созданы с использованием метода трансформации арабидопсиса , называемого цветочным падением, для изучения функции генов.)

Оптическое картирование показало, что у растений было от одного до семи различных вставок или перестроек в их геномах, размером примерно в десять раз. Секвенирование нанопор и реконструкция геномов двух линий подтвердили вставки с разрешением по одной букве, включая целые сегменты ДНК, которые были обменены или перемещены между хромосомами в одной из выбранных линий. Сами вставки генов демонстрировали множество паттернов, причем вставленный фрагмент ДНК иногда скремблирован, инвертирован или даже заглушен.

«Это исследование было невозможно даже год назад», — говорит Майкл. «Секвенирование нанопор, которое некоторые называют« святым Граалем »секвенирования ДНК, революционизировало чтение даже самых сложных областей генома, которые до сих пор были полностью недоступны и неизвестны».

Наконец, когда исследователи изучали пакеты генетического материала, называемого гистонами, они обнаружили дополнительные изменения. Гистоновые белки упаковывают ДНК в структурные единицы, и модификации этих гистонов обеспечивают возможность доступа к гену для использования клеткой (уровень регуляции, называемый эпигенетикой). В зависимости от того, где Т-ДНК была интегрирована, некоторые близлежащие модификации гистонов появлялись или исчезали, потенциально изменяя регуляцию или активацию других соседних генов.

«Теперь у нас есть первое понимание высокого разрешения о том, как вставки Т-ДНК могут формировать локальную среду эпигенома», — говорит Цандер.

Исследователи говорят, что в идеальном мире T-ДНК будет вставлять одну функциональную копию нужного гена без побочных побочных эффектов на геном растения. Хотя их результаты показывают, что это редко встречается у арабидопсиса, их методы предлагают путь к лучшему пониманию и наблюдению за последствиями.

«Эта технология интересна тем, что дает нам более четкое представление о том, что происходит в некоторых из этих трансгенных линий арабидопсиса» , — говорит Ривкин.

«С Arabidopsis это относительно просто, потому что у него такой маленький геном, но из-за постоянного совершенствования технологии секвенирования ДНК, мы ожидаем, что этот подход будет возможен и для сельскохозяйственных культур» , — добавляет Экер, который является председателем Международного совета Salk по генетике. , «Современные методы требуют скрининга сотен трансгенных линий, чтобы найти хорошо работающие линии, такие как без дополнительных вставок, поэтому эта технология может обеспечить более эффективный подход».