Проект «Геном человека» был амбициозной инициативой по секвенированию каждого фрагмента ДНК человека. Проект объединил сотрудников из исследовательских институтов по всему миру, включая Институт биомедицинских исследований Уайтхеда при Массачусетском технологическом институте, и был окончательно завершен в 2003 году. Теперь, более двух десятилетий спустя, профессор Массачусетского технологического института Джонатан Вайсман и его коллеги вышли за рамки последовательности, чтобы представить первый всеобъемлющий функциональная карта генов, которые экспрессируются в клетках человека. Данные этого проекта, опубликованные в Интернете 9 июня в журнале Cell, связывают каждый ген со своей работой в клетке и являются кульминацией многолетнего сотрудничества в области метода секвенирования отдельных клеток Perturb-seq.

Данные доступны для использования другими учеными . «Это большой ресурс в том смысле, в каком геном человека является большим ресурсом, поскольку вы можете пойти и провести исследование, основанное на открытиях», — говорит Вайсман, который также является членом Института Уайтхеда и исследователем Медицинского центра Говарда Хьюза. институт. «Вместо того, чтобы заранее определять, какую биологию вы собираетесь изучать, у вас есть эта карта взаимосвязей генотип-фенотип, и вы можете войти и просмотреть базу данных без необходимости проводить какие-либо эксперименты».

Экран позволил исследователям углубиться в разнообразные биологические вопросы. Они использовали его для изучения клеточных эффектов генов с неизвестными функциями, для исследования реакции митохондрий на стресс и для скрининга генов, вызывающих потерю или приобретение хромосом, — фенотип, который в прошлом было трудно изучать. «Я думаю, что этот набор данных позволит проводить все виды анализа, о которых мы еще даже не догадывались, людям, пришедшим из других областей биологии, и вдруг они просто могут использовать это», — говорит бывший постдок Лаборатории Вайсмана Том. Норман, соавтор статьи.

Новаторская система Perturb-seq

В проекте используется подход Perturb-seq, который позволяет отслеживать влияние включения или выключения генов с беспрецедентной глубиной. Этот метод был впервые опубликован в 2016 году группой исследователей, в которую входили Вайсман и его коллега, профессор Массачусетского технологического института Авив Регев, но его можно было использовать только для небольших наборов генов и с большими затратами.

Массивная карта Perturb-seq стала возможной благодаря фундаментальной работе Джозефа Реплогла, доктора медицинских наук. студент лаборатории Вейсмана и соавтор настоящей статьи. Replogle в сотрудничестве с Норманом, который сейчас возглавляет лабораторию в онкологическом центре Memorial Sloan Kettering; Бритт Адамсон, доцент кафедры молекулярной биологии Принстонского университета; и группа из 10x Genomics намеревалась создать новую версию Perturb-seq, которую можно было бы масштабировать. В 2020 году исследователи опубликовали статью, подтверждающую концепцию, в журнале Nature Biotechnology.

Метод Perturb-seq использует редактирование генома CRISPR-Cas9 для внесения генетических изменений в клетки, а затем использует секвенирование РНК одной клетки для сбора информации о РНК, которые экспрессируются в результате данного генетического изменения. Поскольку РНК контролируют все аспекты поведения клеток, этот метод может помочь расшифровать многие клеточные эффекты генетических изменений.

Начиная с их первоначального документа, подтверждающего концепцию, Вайсман, Регев и другие использовали этот метод секвенирования в меньших масштабах. Например, исследователи использовали Perturb-seq в 2021 году, чтобы изучить, как человеческие и вирусные гены взаимодействуют в ходе инфекции HCMV, распространенным вирусом герпеса.

В новом исследовании Replogle и его сотрудники, включая Рубена Сондерса, аспиранта лаборатории Вайсмана и соавтора статьи, расширили метод до всего генома. Используя клеточные линии рака крови человека, а также нераковые клетки, полученные из сетчатки, он выполнил Perturb-seq для более чем 2,5 миллионов клеток и использовал данные для построения всеобъемлющей карты, связывающей генотипы с фенотипами.

Углубление в данные

После завершения экрана исследователи решили использовать свой новый набор данных и изучить несколько биологических вопросов. «Преимущество Perturb-seq заключается в том, что он позволяет получить большой набор данных беспристрастным образом», — говорит Том Норман. «Никто точно не знает, каковы пределы того, что вы можете получить из такого набора данных. Теперь вопрос в том, что вы на самом деле делаете с этим?»

Первым и наиболее очевидным применением было изучение генов с неизвестными функциями. Поскольку экран также считывал фенотипы многих известных генов, исследователи могли использовать данные для сравнения неизвестных генов с известными и искать сходные результаты транскрипции, что могло бы свидетельствовать о том, что продукты генов работают вместе как часть более крупного комплекса.

Особенно выделялась мутация одного гена, называемого C7orf26. Исследователи заметили, что гены, удаление которых приводило к сходному фенотипу, были частью белкового комплекса под названием Integrator, который играл роль в создании малых ядерных РНК. Комплекс Integrator состоит из множества более мелких субъединиц — предыдущие исследования предполагали 14 отдельных белков — и исследователи смогли подтвердить, что C7orf26 составляет 15-й компонент комплекса.

Они также обнаружили, что 15 подразделений работали вместе в более мелких модулях для выполнения определенных функций в комплексе «Интегратор». «Без этого обзора ситуации с высоты в тысячу футов было не так ясно, что эти разные модули были настолько функционально различны», — говорит Сондерс.

Еще одно преимущество Perturb-seq заключается в том, что, поскольку анализ фокусируется на отдельных клетках, исследователи могут использовать данные для изучения более сложных фенотипов, которые становятся запутанными, когда их изучают вместе с данными из других клеток. «Мы часто берем все клетки, в которых сбит «ген X», и усредняем их вместе, чтобы посмотреть, как они изменились», — говорит Вайсман. «Но иногда, когда вы сбиваете ген, разные клетки, которые теряют один и тот же ген, ведут себя по-разному, и в среднем это поведение может быть пропущено».

Исследователи обнаружили, что за сегрегацию хромосом отвечает подмножество генов, удаление которых приводило к разным результатам от клетки к клетке. Их удаление приводило к тому, что клетки теряли хромосому или приобретали лишнюю, состояние, известное как анеуплоидия. «Вы не могли предсказать, какой будет реакция транскрипции на потерю этого гена, потому что она зависела от вторичного эффекта того, какую хромосому вы приобрели или потеряли», — говорит Вайсман. «Мы поняли, что затем можем перевернуть это и создать этот составной фенотип, ища сигнатуры приобретенных и потерянных хромосом. Таким образом, мы провели первый полногеномный скрининг факторов, которые необходимы для правильной сегрегации ДНК. »

«Я думаю, что исследование анеуплоидии — самое интересное применение этих данных на данный момент», — говорит Норман. «Он фиксирует фенотип, который вы можете получить только с помощью считывания одной клетки. Вы не можете получить его каким-либо другим способом».

Исследователи также использовали свой набор данных для изучения реакции митохондрий на стресс. Митохондрии, которые произошли от свободноживущих бактерий, несут в своем геноме 13 генов. В ядерной ДНК около 1000 генов так или иначе связаны с митохондриальной функцией. «Люди давно интересовались тем, как ядерная и митохондриальная ДНК координируются и регулируются в различных клеточных условиях, особенно когда клетка подвергается стрессу», — говорит Реплогл.

Исследователи обнаружили, что когда они нарушали различные гены , связанные с митохондриями, ядерный геном реагировал аналогичным образом на множество различных генетических изменений. Однако ответы митохондриального генома были гораздо более вариабельными.

«Все еще остается открытым вопрос, почему митохондрии все еще имеют свою собственную ДНК», — сказал Реплогл. «Общий вывод из нашей работы заключается в том, что одним из преимуществ наличия отдельного митохондриального генома может быть локализованная или очень специфическая генетическая регуляция в ответ на различные стрессоры».

«Если у вас есть одна митохондрия, которая сломана, и другая, которая сломана по-другому, эти митохондрии могут реагировать по-разному», — говорит Вайсман.

В будущем исследователи надеются использовать Perturb-seq на других типах клеток, помимо линии раковых клеток, с которой они начали. Они также надеются продолжить изучение своей карты функций генов и надеются, что другие сделают то же самое. «Это действительно кульминация многолетней работы авторов и других сотрудников, и я очень рад видеть, что она продолжает развиваться и расширяться», — говорит Норман.