Опухоли могут нести мутации в сотнях различных генов, и каждый из этих генов может мутировать по-разному: некоторые мутации просто заменяют один нуклеотид ДНК другим, в то время как другие вставляют или удаляют более крупные участки ДНК.

До сих пор не было возможности быстро и легко проверить каждую из этих мутаций в их естественной среде, чтобы увидеть, какую роль они могут играть в развитии, прогрессировании и реакции на лечение опухоли. Используя вариант редактирования генома CRISPR, известный как первичное редактирование, исследователи MIT теперь придумали способ гораздо проще проверять эти мутации.

Исследователи продемонстрировали свою технику, проверив клетки с более чем 1000 различными мутациями гена-супрессора опухолей р53, все из которых наблюдались у онкологических больных . Этот метод, который проще и быстрее, чем любой другой существующий подход, и который редактирует геном, а не вводит искусственную версию мутантного гена, показал, что некоторые мутации р53 более вредны, чем считалось ранее.

По словам исследователей, этот метод также может быть применен ко многим другим раковым генам и в конечном итоге может быть использован в точной медицине, чтобы определить, как опухоль отдельного пациента будет реагировать на конкретное лечение.

«В одном эксперименте вы можете создать тысячи генотипов, которые наблюдаются у больных раком, и немедленно проверить, являются ли один или несколько из этих генотипов чувствительными или устойчивыми к любому типу терапии, в использовании которой вы заинтересованы», — говорит Франсиско Санчес. Ривера, доцент кафедры биологии Массачусетского технологического института, член Института интегративных исследований рака Коха и старший автор исследования.

Аспирант Массачусетского технологического института Сэмюэл Гулд является ведущим автором статьи, которая сегодня опубликована в журнале Nature Biotechnology.

Редактирование ячеек

Новая методика основана на исследованиях , которые Санчес-Ривера начал 10 лет назад, будучи аспирантом Массачусетского технологического института. В то время, работая с Тайлером Джексом, профессором биологии Дэвида Х. Коха, и тогдашним постдоком Фалесом Папагианнакопулосом, Санчес-Ривера разработал способ использования редактирования генома CRISPR для введения мышам генетических мутаций , связанных с раком легких .

В этом исследовании ученые показали, что они могут удалять гены, которые часто теряются в опухолевых клетках легких, и полученные в результате опухоли похожи на естественно возникающие опухоли с этими мутациями. Однако этот метод не позволял создавать точковые мутации (замены одного нуклеотида на другой) или вставки.

«Хотя у некоторых больных раком есть делеции в определенных генах, подавляющее большинство мутаций в опухолях больных раком также включают точечные мутации или небольшие вставки», — говорит Санчес-Ривера.

С тех пор Дэвид Лю, профессор факультета химии и химической биологии Гарвардского университета и член основного института Института Броуда, разработал новые технологии редактирования генома на основе CRISPR, которые могут легче генерировать дополнительные типы мутаций. Благодаря редактированию баз, разработанному в 2016 году, исследователи могут создавать точковые мутации, но не все возможные точковые мутации. В 2019 году Лю, который также является автором исследования Nature Biotechnology, разработал метод, называемый простым редактированием, который позволяет вводить любые точечные мутации, а также вставки и удаления.

«Теоретически простое редактирование решает одну из основных проблем более ранних форм редактирования на основе CRISPR, а именно то, что оно позволяет создавать практически любой тип мутации», — говорит Санчес-Ривера.

Когда они начали работать над этим проектом, Санчес-Ривера и Гулд подсчитали, что в случае успешного выполнения простое редактирование можно будет использовать для генерации более 99% всех небольших мутаций, наблюдаемых у больных раком.

Однако для этого им нужно было найти способ оптимизировать эффективность редактирования системы на основе CRISPR. Основные направляющие РНК редактирования (pegRNA), используемые для направления ферментов CRISPR на разрезание генома в определенных местах, имеют разные уровни эффективности, что приводит к «шуму» в данных от pegRNA, которые просто не генерируют правильную целевую мутацию. Команда Массачусетского технологического института разработала способ уменьшить этот шум, используя синтетические сайты-мишени, чтобы помочь им рассчитать, насколько эффективно работает каждая протестированная ими направляющая РНК.

«Мы можем создать несколько направляющих РНК первичного редактирования с различными конструктивными свойствами, а затем получить эмпирическое измерение того, насколько эффективна каждая из этих пегРНК. Это говорит нам, в каком проценте случаев каждая пегРНК фактически вносит правильное редактирование», — Гулд говорит.

Анализ мутаций

Исследователи продемонстрировали свою технику, используя p53, ген, который мутирует более чем у половины всех больных раком. Из набора данных, включающего информацию о секвенировании более чем 40 000 пациентов, исследователи выявили более 1000 различных мутаций, которые могут возникать в р53.

«Мы хотели сосредоточиться на р53, потому что это наиболее часто мутирующий ген при раке человека, но действительно глубоко изучены только наиболее частые варианты р53. Есть много вариантов р53, которые остаются недостаточно изученными», — говорит Гулд.

Используя свой новый метод, исследователи ввели мутации р53 в клетки аденокарциномы легких человека, а затем измерили выживаемость этих клеток, что позволило им определить влияние каждой мутации на приспособленность клеток.

Среди своих результатов они показали, что некоторые мутации р53 способствуют росту клеток больше, чем считалось ранее. Эти мутации, которые не позволяют белку p53 образовывать тетрамер — сборку из четырех белков p53, — были изучены ранее с использованием метода, который включает в себя вставку искусственных копий мутировавшего гена p53 в клетку.

Эти исследования показали, что эти мутации не дают раковым клеткам никакого преимущества в выживании. Однако когда команда Массачусетского технологического института представила те же самые мутации, используя новую технику редактирования простых чисел, они обнаружили, что мутация препятствует образованию тетрамера, позволяя клеткам выжить. На основании исследований, проведенных с использованием сверхэкспрессии искусственной ДНК р53, эти мутации можно было бы классифицировать как доброкачественные, хотя новая работа показывает, что в более естественных обстоятельствах это не так.

«Это тот случай, когда вы можете наблюдать эти фенотипы, индуцированные вариантами, только если вы создаете варианты в их естественном контексте, а не с помощью этих более искусственных систем», — говорит Гулд. «Это всего лишь один пример, но он говорит о более широком принципе: мы сможем получить доступ к новой биологии, используя эти новые технологии редактирования генома».

Поскольку реактивировать гены-супрессоры опухолей сложно, существует мало лекарств, нацеленных на р53, но теперь исследователи планируют исследовать мутации, обнаруженные в других генах, связанных с раком, в надежде обнаружить потенциальные методы лечения рака, которые могли бы воздействовать на эти мутации. Они также надеются, что однажды этот метод сможет обеспечить персонализированный подход к лечению опухолей.

«С появлением в клинике технологий секвенирования мы сможем использовать эту генетическую информацию для адаптации терапии для пациентов, страдающих опухолями с определенным генетическим составом», — говорит Санчес-Ривера. «Этот подход, основанный на простом редактировании, может изменить все».