Экспериментальное исследование показывает, что новый метод проверки функции тромбоцитов в образце крови человека быстрее, проще и точнее, чем методы, используемые в настоящее время.

Компания Nature Biomedical Engineering опубликовала исследование, проведенное учеными из Университета Эмори.

Исследователи продемонстрировали доказательство концепции метода, который дает первое подробное представление о молекулярных силах, генерируемых активированными тромбоцитами в образцах крови пациентов.

Результаты исследования показывают, что эта технология имеет потенциал для оценки воздействия антитромбоцитарных препаратов на отдельных лиц и получения более четкой картины рисков кровотечений у пациентов, перенесших операцию по искусственному кровообращению.

Для проведения этого метода требуется всего лишь капля крови по сравнению со столовой ложкой, необходимой для текущих анализов. Эта сверхчувствительность может сделать эту технологию ценным инструментом для диагностики детей, страдающих редкими врожденными нарушениями тромбоцитов.

Прорыв основан на тестах натяжения синтетической ДНК, разработанных более десяти лет назад в лаборатории Халида Салаиты, профессора химического факультета Эмори, и кафедры биомедицинской инженерии Уоллеса Х. Коултера в Технологическом институте Эмори и Джорджии.

«Мечта учёного»

Датчики натяжения могут обнаруживать клеточные силы величиной всего в несколько пиконьютонов, что примерно в миллиард раз меньше веса скрепки для бумаг. Исследователи нашли способ усилить сигнал зондов, используя мощность фермента, известного как CRISPR-ассоциированный 12а. Затем механический сигнал детектируется с помощью устройства для считывания планшетов — инструмента, обычно используемого в клинических испытаниях.

«Этот проект начался из простого любопытства», — говорит Салайта, соавтор. «Мы хотели знать, сможем ли мы измерить мельчайшие силы, действующие на клетки. Удивительно, что теперь мы опираемся на это базовое любопытство для разработки диагностических инструментов, которые помогут пациентам. Это мечта ученого».

Первым автором статьи является Юксин Дуань, постдокторант Американской кардиологической ассоциации в лаборатории Салайта.

Роман Снечински, профессор кафедры анестезиологии Медицинской школы Эмори и ведущий эксперт в области периоперационной коагуляции, является соавтором статьи.

«Функция тромбоцитов в целом важна, но современные инструменты, с помощью которых мы можем ее измерить, относительно примитивны», — говорит Снечински. «Этот новый метод предлагает более простой, быстрый и дешевый способ измерения функции тромбоцитов , а также предоставляет нам ключевую информацию, которой у нас не было раньше».

Важность тромбоцитов

Тромбоциты представляют собой бесцветные дискообразные фрагменты клеток крови, задача которых заключается в связывании на месте поврежденного кровеносного сосуда и остановке кровотечения. Однако в некоторых случаях тромбоциты могут функционировать не оптимально. Когда тромбоциты слабы или менее активны, чем оптимально, кровь может не свертываться должным образом, что приводит к неконтролируемому кровотечению. Но если тромбоциты «гиперактивны», они могут стать слишком липкими и вызвать спонтанное образование тромбов, что может привести к сердечному приступу или инсульту.

Регулирование функции тромбоцитов особенно важно для людей с повышенным риском развития некоторых заболеваний. Антиагреганты, такие как клопидогрел, тикагрелор и даже аспирин, являются одними из наиболее часто назначаемых лекарств в Соединенных Штатах. Однако у некоторых пациентов эти препараты могут оказаться неэффективными, и корректировка доз или переход на другой препарат может лучше помочь предотвратить сердечные приступы.

Во время кардиохирургии функция тромбоцитов нарушается еще сильнее. Операционная бригада должна выполнить балансирующее действие, предотвращая свертывание крови во время искусственного кровообращения, а затем использовать прокоагулянтные вмешательства, включая переливание тромбоцитов, чтобы остановить кровотечение после завершения хирургической процедуры. Это может быть сложно, поскольку использование аппарата искусственного кровообращения может вызвать стресс и ослабить тромбоциты.

«На протяжении десятилетий люди писали в научной литературе об этой проблеме дисфункции тромбоцитов во время кардиохирургических операций», — говорит Сниечинский, — «но действительно трудно измерить ее с помощью инструментов, которые мы используем. способность хорошо измерять функцию тромбоцитов затрудняет ее эффективное изучение».

«Маленькая часть картины»

Агрегометрия — стандартный инструмент, используемый в настоящее время для оценки функции тромбоцитов. Он измеряет скорость и степень, с которой тромбоциты в образце крови слипаются или агрегируются.

«Эти данные дают лишь небольшую часть картины функции тромбоцитов, и это не самая интересная часть», — говорит Снечински.

Он объясняет, что когда тромбоцит активируется, он меняет свою морфологию и у него вырастают крошечные псевдо-руки. Тромбоциты используют эти рычаги для захвата цепочек белков крови, называемых фибриногеном, с образованием сгустков.

«Агрегометрия показывает, что тромбоциты слипаются», — говорит Снечински. «Но это не говорит вам об их уровне активации — о количестве силы, которую они используют, чтобы удерживать другие белки коагуляции, а также друг друга».

Усиление сигнала

Лаборатория Салайта является лидером в визуализации и измерении механических сил, приложенных клетками, с использованием зондов натяжения, изготовленных из синтетических нитей двухцепочечной ДНК, прикрепленных к поверхности.

Двойные цепи ДНК можно запрограммировать на связывание с клетками тромбоцитов. Когда клетки связываются и прикладывают силу к закрепившейся ДНК, ДНК расщепляется на две нити, оставляя одну нить прилипшей к поверхности. Полученный физический рывок преобразуется в флуоресцентный сигнал.

Однако основная проблема при чтении этого сигнала заключается в том, что эти физические рывки слабы, мимолетны и нечасты. Для их обнаружения требуется микроскоп.

Во время пандемии COVID-19 фермент CRISPR 12a, или Cas12a, вышел на первый план в качестве диагностического инструмента для вируса SARS-CoV-2. Бактерии используют Cas12a для защиты от фагов или вирусов, атакующих бактерии. Фермент Cas12a может быть загружен одноцепочечной «направляющей» РНК, которая запрограммирована связываться с комплементарной одноцепочечной ДНК. Затем фермент реагирует на одноцепочечную ДНК, разрушая другую одноцепочечную ДНК, окружающую ее.

Лаборатория Салайты решила объединить Cas12a со своими датчиками напряжения, чтобы посмотреть, будет ли фермент усиливать сигнал механических сил, оказываемых тромбоцитами. Лаборатория разработала так называемый датчик натяжения Mechano-Cas12a, или MCATS.

«Это сработало как настоящая банда», — говорит Салайта.

«Cas12a ведет себя тихо и неактивно, если не видит своей цели», — объясняет он. «Но как только он видит определенную одноцепочечную ДНК, он сходит с ума и начинает разрушать любую одноцепочечную ДНК, с которой сталкивается. Эта активация генерирует мощный выходной сигнал флуоресценции».

MCATS является точным и сверхчувствительным устройством, способным измерять силы клеточного растяжения, создаваемые всего лишь 2000 тромбоцитами в образце. Результирующий сигнал достаточно устойчив, чтобы его можно было измерить с помощью обычного флюорометра — инструмента, обычно используемого при рутинных анализах крови.

MCATS также работает с устройством для считывания планшетов — инструментом, предназначенным для одновременной обработки десятков образцов, что обеспечивает высокую пропускную способность считывания, необходимую для проведения исследований.

Тестирование его клинического потенциала

Чтобы проверить эффективность MCATS при измерении активности функции тромбоцитов, исследователи взяли образцы крови у здоровых доноров-добровольцев. Сначала они подтвердили, что реакция MCATS чувствительна к механическим силам тромбоцитов.

Затем они добавили к образцам крови здоровых людей различные антитромбоцитарные препараты, начиная от безрецептурного аспирина и заканчивая набором различных рецептурных лекарств. Результаты MCATS показали, что антиагрегантная терапия снижает механическую активность тромбоцитов на величину, аналогичную снижению, наблюдаемому при агрегометрии.

Исследователи также получили разрешение взять образцы крови для исследования у семи пациентов до и после операции по искусственному кровообращению. Результаты показали, что показания MCATS активности тромбоцитов в образце каждого отдельного пациента коррелировали с вероятностью необходимости переливания тромбоцитов для минимизации кровотечения после операции.

В настоящее время исследователи набирают участников в проспективное исследование для дальнейшего изучения MCATS в качестве диагностического инструмента. Людям с диагнозом нарушения тромбоцитов будут проверять образцы крови до и после лечения, чтобы оценить, насколько хорошо терапия работает.

«Суть в том, что MCATS — это совершенно новый способ измерения функции тромбоцитов с использованием действительно крошечного образца», — говорит Снечински. «Это говорит нам о чем-то конкретном, что мы раньше не могли измерить, и это может дать нам новый способ понять, что происходит с дисфункцией тромбоцитов, и найти лучшие методы ее контроля».

«Обследование крови дает вам базовую информацию о вашем здоровье на основе таких данных, как количество тромбоцитов и метаболические концентрации», — добавляет Салайта. «Теперь мы добавляем информацию о механизме действия тромбоцитов. Это похоже на появление на вашей приборной панели совершенно нового циферблата для мониторинга вашего здоровья».