Группа под руководством профессора Чжан Каймина из Университета науки и технологий (USTC) определила шесть конформаций во втором этапе самосплайсинга рибозима Tetrahymena с помощью криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ), раскрыв механизм координации интронов группы 1. реакции саморасщепления. Их работа была опубликована в Nature Communications.
Интроны группы Ⅰ представляют собой каталитические РНК, которые могут складываться в третичную структуру с активным центром с помощью ионов металлов, тем самым способствуя катализу без белков. Однако анализ структур РНК сталкивается с огромными проблемами из-за гетерогенности и гибкости РНК. С момента открытия интронов группы I Tetrahymena многочисленные исследования прояснили лежащий в их основе каталитический механизм, но трехмерная структура полноразмерной молекулы и ее перестройки еще не получены.
Чтобы определить структурный механизм и конформационные изменения в реакциях самосращивания, команда профессора Чжан Каймина сначала разработала субстраты для реакций самосращивания. Убедившись, что субстраты могут завершать каталитические реакции, и определив оптимальные условия реакции, команда сделала снимки структуры различных конформаций рибозима Tetrahymena во время процесса самообогащения с помощью крио-ЭМ-анализа отдельных частиц.
Первый этап начинается с спаривания оснований олигонуклеотидного субстрата с апоферментом с образованием дуплекса удлинения P1-P1. После этого третичные взаимодействия между P1 и тремя одноцепочечными сегментами внутри каталитического ядра опосредуют стыковку дуплекса с активным центром .
Затем высвобождается олигонуклеотидный продукт первой стадии. Второй этап — это реакция лигирования, при которой субстраты 3′-экзонов закрепляются в рибозиме за счет третичных контактов и координации металлов. Затем реакция постепенно переходит в промежуточный период, когда координация металлов ослабевает и утрачиваются третичные взаимодействия.
В этот период экзоны лигируются. Затем рибозим релаксирует, и дуплекс продукта отстыковывается, достигая участка, свободного от субстрата. Наконец, дуплекс отсоединяется, и продукт выпускается. Кроме того, исследователи также обнаружили структурные доказательства перестройки некоторых водородных связей и ионов металлов в активных центрах, которые способствуют катализу и координируют реакции самосращивания.
Это исследование раскрыло механизм реакции самосплайсинга на атомном уровне , доказав преимущества использования крио-ЭМ для разрешения структуры РНК. По мере расширения применения крио-ЭМ в исследованиях структурно гетерогенных молекул она станет жизненно важным инструментом во многих других биологических исследованиях , таких как укладка систем РНК.
