В ходе разработки, которая может ускорить открытие новых методов диагностики и лечения, исследователи из Детской больницы Филадельфии (CHOP) разработали универсальную и недорогую технологию для целенаправленного секвенирования полноразмерных молекул РНК. Технология, получившая название TEQUILA-seq, отличается высокой экономической эффективностью по сравнению с имеющимися в продаже решениями для направленного секвенирования РНК и может быть адаптирована для различных исследовательских и клинических целей. Подробности описаны в статье в Nature Communications .
На пути от гена к белку молекула РНК может быть разрезана и соединена различными способами, прежде чем транслироваться в белок. Этот процесс известен как альтернативный сплайсинг, и он позволяет одному гену кодировать несколько разных белков. Хотя альтернативный сплайсинг происходит во многих биологических процессах , он может быть нарушен при таких заболеваниях, как рак, что приводит к образованию патогенных молекул РНК. Чтобы понять, как альтернативный сплайсинг может привести к заболеванию, исследователям необходимо иметь точный учет всех молекул РНК (известных как «изоформы транскриптов»), происходящих из одного гена.
Одним из способов сделать это является использование платформ для секвенирования РНК с «длинным считыванием», которые секвенируют молекулы РНК длиной более 10 000 оснований от начала до конца, захватывая все изоформы транскриптов. Тем не менее, эти долгочитаемые платформы имеют скромный результат секвенирования, что препятствует их широкому внедрению, особенно в клинических условиях, поскольку получение данных секвенирования РНК с длительным чтением на клинически информативной глубине может быть непомерно дорогим. Направленное секвенирование, которое включает в себя обогащение определенных представляющих интерес последовательностей нуклеиновых кислот перед секвенированием, является полезной стратегией, которая может существенно расширить охват предопределенных мишеней, но стоимость и сложность захвата мишеней препятствуют более широкому использованию.
«Целенаправленное секвенирование РНК с длинным чтением — это мощная стратегия для выяснения репертуара РНК для любого предопределенного набора генов. Однако существующие технологии целевого секвенирования полноразмерных молекул РНК либо дороги, либо сложны в настройке, что делает их недоступными. для многих лабораторий», — сказал соавтор Лан Лин, доктор философии, доцент кафедры патологии и лабораторной медицины и член Центра клеточной и молекулярной терапии Раймонда Г. Перельмана в CHOP. «TEQUILA-seq решает эту проблему, будучи недорогим и простым в использовании. Технология может быть адаптирована пользователями для различных целей, и исследователи могут выбирать, какие гены они хотят секвенировать, и создавать реагенты для захвата мишеней в своих собственных лабораториях.
Один из методов, который позволяет проводить целевое секвенирование, называется обогащением на основе гибридизационного захвата, в котором в качестве зондов захвата используются короткие фрагменты нуклеиновых кислот, называемые олигонуклеотидами. Эти олигонуклеотиды (часто называемые просто «олиго») помечены молекулами биотина и предназначены для гибридизации со своими мишенями на основе комплементарности последовательностей нуклеиновых кислот, что позволяет легко захватывать и выделять их последовательности-мишени из биологического образца. Однако, хотя обогащение на основе гибридизационного захвата является эффективным методом целевого секвенирования, коммерчески синтезированные биотинилированные зонды захвата дороги и могут использоваться только для ограниченного числа реакций, что делает высокую стоимость образца для каждой реакции захвата.
Чтобы устранить это ограничение, исследователи CHOP разработали TEQUILA-seq (обогащение и количественная оценка транскриптов с использованием изотермически линейно-амплифицированных зондов в сочетании с секвенированием с длительным считыванием). Ключевым нововведением в TEQUILA-seq является реакция амплификации изотермического смещения цепи, запускаемая эндонуклеазой разрыва, которая может синтезировать большое количество биотинилированных зондов захвата из дешевого пула небиотинилированных олигонуклеотидов в качестве матриц. Используя всего 2 нг матричных олигонуклеотидов, исследователи могут создать 25 мкг зондов TEQUILA, которые можно использовать как минимум для 250 реакций захвата. Эта инновационная стратегия синтеза захватных зондов делает TEQUILA-seq очень рентабельной и масштабируемой для больших целевых панелей и многих биологических образцов.
Чтобы оценить его производительность, исследователи выполнили TEQUILA-seq для нескольких панелей генов на синтетических РНК или РНК человека. Зонды TEQUILA работали так же, как коммерческие зонды захвата при захвате и обогащении мишеней, при этом они были в сотни раз дешевле для каждой реакции захвата. Кроме того, исследователи продемонстрировали, что TEQUILA-seq может значительно улучшить обнаружение, сохраняя при этом количественную оценку молекул РНК-мишеней.
«Используя дешевые реагенты и простой экспериментальный рабочий процесс, TEQUILA-seq позволяет нам глубоко секвенировать полноразмерные молекулы РНК для любого набора генов во многих биологических образцах», — сказал соавтор И Син, доктор философии, директор Центра. для вычислительной и геномной медицины в CHOP. «Это очень интересно и позволяет использовать широкий спектр медицинских приложений, от генетической диагностики с помощью РНК до разработки терапии».
Чтобы проиллюстрировать его биомедицинскую полезность, исследователи применили TEQUILA-seq для профилирования полноразмерных молекул РНК 468 активных генов рака в 40 клеточных линиях рака молочной железы. Они обнаружили ранее неизвестные изоформы транскриптов в широко изученных генах рака, которые могут пролить свет на то, как гены, защищающие организм от рака, инактивируются в отдельных опухолях.
«Наша работа показывает, что TEQUILA-seq можно широко использовать для целенаправленного секвенирования полноразмерных молекул РНК», — сказал доктор Лин. «Более того, зонды TEQUILA — это зонды захвата общего назначения. Они совместимы как для таргетного секвенирования РНК, так и для секвенирования ДНК, как на платформах секвенирования с длинным, так и с коротким считыванием. Возможность легко генерировать большое количество биотинилированных зондов захвата для любой целевой панели. по низкой цене и с легкостью может способствовать проведению крупномасштабных исследований на уровне населения для многих базовых, трансляционных и клинических приложений».
