Используя нанопоровое секвенирование, инструмент быстрого цитогенетического анализа третьего поколения, исследователи теперь могут точно выявлять специфические геномные нарушения за долю времени, которое требуется для проведения традиционного и молекулярного цитогенетического тестирования. Это облегчает раннюю диагностику генетических нарушений и ускоряет соответствующее клиническое ведение пациентов и их семей. Их работа опубликована в The Journal of Molecular Diagnostics.
Нанопоровое секвенирование — это масштабируемая технология секвенирования третьего поколения, которая позволяет проводить прямой анализ длинных фрагментов ДНК или РНК в режиме реального времени. Среди широкого спектра возможных применений он оказался эффективным для определения вариантов номера копии (CNV). CNV представляют собой дополнительные или отсутствующие копии генетического материала в хромосомах , и они лежат в основе многих неврологических, психических и пороков развития. Обычно CNV исследуют с помощью цитогеномных методов со значительными ограничениями с точки зрения разрешения и времени выполнения.
«Традиционная цитогенетика и анализ хромосомных микрочипов по-прежнему являются золотым стандартом для обнаружения больших и малых CNV соответственно, а секвенирование второго поколения, разработанное для различных генетических изменений, было адаптировано для выявления CNV», — пояснил ведущий исследователь Альберто Маги, доктор философии. доктор философии, кафедра информационной инженерии, Флорентийский университет, Флоренция; и Институт биомедицинских технологий, Национальный исследовательский совет, Сеграте, Милан, Италия. «Но поскольку они медленные, дорогие и часто безрезультатные, пациентам проводят последовательные генетические тесты до тех пор, пока не будет окончательно определена основная генетическая причина. Это может привести к неделям или даже месяцам диагностической неопределенности. , долгосрочное секвенирование нанопор, может ускорить этот процесс».
Секвенирование нанопор с длительным считыванием может разрешить как высоко гомологичные, так и повторяющиеся геномные области, улучшая обнаружение и картирование CNV. Технологии Nanopore просты в использовании и позволяют завершить цикл секвенирования за 24–48 часов. У них есть дополнительное преимущество, позволяющее анализировать данные в режиме реального времени во время процесса секвенирования, что может значительно сократить время обнаружения. Этот эффективный диагностический инструмент подходит для широкого использования в генетических лабораториях.
Исследователи протестировали образцы ДНК семи пациентов с ранее выявленными CNV разного размера и степени мозаичности (т. е. CNV присутствовал не во всех клетках организма, а в их части). Образцы были проанализированы с использованием технологии секвенирования нанопор с длительным считыванием Nano-GLADIATOR. Он использовался в онлайн-режиме для анализа прочтений в реальном времени в несколько моментов времени от 30 минут до 48 часов и в автономном режиме для оценки разрешения полных прогонов нанопор для геномных изменений разных размеров. Время от образца до результата сравнивали с современной сравнительной геномной гибридизацией на основе массивов (aCGH). Исследователи также оценили чувствительность и специфичность секвенирования нанопор для идентификации патогенных малых CNV.
Исследование показало, что диагноз более крупных хромосомных изменений можно поставить за один день, в то время как время обработки для более мелких CNV оценивается в два дня. Это представляет собой постоянное улучшение по сравнению с обычными диагностическими тестами на CNV, при этом расчетное время сообщения составляет от трех до 15 дней.
Кроме того, нанопоровое секвенирование может идентифицировать мозаичные CNV с более высокой чувствительностью, чем aCGH. Фактически, он диагностировал мозаичную CNV в образце пациента, который не был обнаружен диагностическими алгоритмами aCGH.
«Патогенные мозаичные структурные варианты были выявлены примерно у 0,3–0,77% пациентов с нарушениями развития », — соисследователи Томмазо Пиппуччи, доктор философии, и Памела Магини, доктор философии, UO Genetica Medica, IRCCS Azienda Ospedaliero. — Universitaria di Bologna, Болонья, Италия, наблюдал. «Поскольку чувствительность существующих методов выявления мозаицизма у CNV ограничена, частота может быть недооценена. Более того, мозаицизм может быть пропущен у родителей детей с патогенными CNV de novo, что приводит к неточным рекомендациям по риску рецидива и неправильному ведению будущих беременностей. »
«В последние десятилетия медицинская генетика произвела революцию благодаря стремительным технологическим инновациям. Секвенирование с помощью нанопор идеально вписывается в эту биомедицинскую революцию, улучшая обнаружение класса геномных изменений, которые упускались из виду по техническим причинам», — добавила соавтор исследования Алессандра Мингрино. доктор философии и Барбара Гега, бакалавр наук, кафедра экспериментальной и клинической медицины Флорентийского университета, Флоренция, Италия. «Внедрение быстрых технологий может значительно сократить техническое время и значительно улучшить диагностику геномных нарушений, вызванных хромосомными изменениями».
